PCR và qPCR: Lựa chọn vật tư thí nghiệm phù hợp như thế nào?

Với nhiều thương hiệu, thông số kỹ thuật, màu sắc, … khác nhau, vật tư tiêu hao PCR rất đa dạng nhưng đôi lúc cũng tạo nên sự bối rối khi lựa chọn. Hãy cùng tìm hiểu nhanh các khía cạnh để hiểu được loại phù hợp cho thí nghiệm của mình nhé.

1. VẬT LIỆU

Thông thường, nguyên liệu sản xuất vật tư tiêu hao PCR là polypropylene. Đây là vật liệu trơ chịu nhiệt tốt. Phạm vi nhiệt độ hoạt động là -30 đến 140℃, giúp nó có thể chịu được sự thay đổi năng lượng nhiệt trong chu trình nhiệt của phản ứng PCR và có thể tạo môi trường phản ứng kín đồng thời bảo vệ tốt các thành phần phản ứng.

2. MÀU SẮC

Các loại ống PCR hay đĩa vi giếng phổ biến có màu trắng hoặc trong suốt. Đối với các thí nghiệm PCR truyền thống, không có sự khác biệt giữa hai loại này. Tuy nhiên, trong cùng một thí nghiệm real-time/qPCR, ống hay đĩa PCR màu trắng tương đối nhạy hơn và tín hiệu thu nhận nhất quán hơn khi dùng cho các thiết bị qPCR có kiểu đọc tín hiệu từ trên xuống. Tại sao lại như vậy?

Giá trị kết quả cốt lõi của phản ứng qPCR là giá trị Ct và tín hiệu huỳnh quang là nguồn dữ liệu để tính toán giá trị Ct, do đó, việc tín hiệu huỳnh quang trong ống có thể được truyền hoàn toàn đến đầu dò hay không là rất quan trọng. Thành ống màu trắng ngăn tín hiệu huỳnh quang đi qua thành ống và khúc xạ (Hình A bên dưới), do đó cũng ngăn các tín hiệu này được truyền đến mô-đun gia nhiệt (tức là thành lỗ kim loại nơi đặt ống) và bị thành lỗ kim loại hấp thụ hoặc phản xạ không nhất quán. Kết quả là, tín hiệu huỳnh quang sẽ mạnh hơn, tập trung hơn so với ống trong suốt (Hình B bên dưới).

Tip: Nếu bạn đang sử dụng thiết bị qPCR đọc từ trên xuống, bạn có thể thử với ống PCR hoặc đĩa vi giếng màu trắng.

3. CHẤT LƯỢNG (Sạch hay Không)

Tầm quan trọng của chất lượng vật tư tiêu hao cần được nhấn mạnh. Đặc biệt đối với phản ứng qPCR, vật tư tiêu hao phải không có chất gây ô nhiễm và chất ức chế. Áp suất cao và bức xạ có thể loại bỏ vi khuẩn và DNase, nhưng không loại bỏ được bụi và cặn DNA, có thể ức chế phản ứng PCR hoặc tạo ra sự khuếch đại không đặc hiệu. Các chất có khả năng hấp thụ và ngay cả các chất ô nhiễm nhỏ cũng sẽ hấp thụ huỳnh quang khi phản ứng xảy ra, ảnh hưởng kết quả thu nhận tín hiệu huỳnh quang. Tham khảo trong một thử nghiệm mà tạp chất đã được cho vào một trong các giếng phản ứng của dải 8 ống PCR. Kết quả sau khi chạy phản ứng, đường cong khuếch đại cho thấy những bất thường đáng kể.

Tip: Cẩn thận không để ống PCR/đĩa PCR tiếp xúc với không khí trong thời gian dài. Sau khi lấy ra một lượng đủ dùng, hãy đảm bảo đóng kín túi đựng ngay. Nếu có thể, nên thao tác chuẩn bị mẫu trong tủ PCR hoặc tủ laminar.

4. DUNG LƯỢNG/KÍCH CỠ

Thể tích xác định số lượng mẫu có thể được nạp (thể tích phản ứng). Lượng mẫu quá nhiều có thể dẫn đến giảm hiệu suất truyền nhiệt, tràn hoặc nhiễm chéo; trong khi lượng mẫu không đủ có thể gây ra mất mát do bay hơi của mẫu. Mô-đun/block gia nhiệt của thiết bị PCR/qPCR cũng sẽ đưa ra thông số kỹ thuật cho thể tích ống /đĩa PCR và thể tích mẫu phù hợp. 

Thông số kỹ thuật về dung lượng cũng thường được phân biệt giữa vật tư nhựa tiêu chuẩn (thể tích 0.2ml) và low-profile (thể tích 0,1ml). Dạng low-profile có chiều cao thấp hơn. Thiết kế ống ngắn giúp giảm thiểu không gian phía trên phản ứng (thể tích chết), giảm ảnh hưởng của sự bay hơi trong chu trình nhiệt và cho phép mô-đun gia nhiệt bao phủ tốt hơn, cải thiện hiệu quả truyền nhiệt. 

Tip: Nhìn chung, thể tích phản ứng phổ biến là 20 µL, nên sử dụng ống phản ứng có thể tích nhỏ 0,1 mL. Tuy nhiên, kỹ thuật viên cần cẩn thận khi thao tác với ống hay đĩa vi giếng thể tích nhỏ vì sẽ khó khăn hơn, đặc biệt là khi chuẩn bị mẫu trong khay đá, có thể sử dụng rack giữ lạnh để hỗ trợ thao tác, truyền nhiệt và giữ nhiệt độ đồng đều và giữ nhiệt được lâu.

5. ĐỘ DÀY THÀNH ỐNG/ĐĨA VI GIẾNG

Độ dày của thành ống sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ dẫn nhiệt. Vật tư tiêu hao PCR phải có độ dày thành ống đồng đều để truyền nhiệt đồng đều. Thành ống mỏng sẽ làm giảm thêm rào cản nhiệt và mang lại hiệu ứng phản ứng nhanh hơn và tốt hơn. Do đó, để tối đa hóa hiệu quả của phản ứng PCR, đảm bảo phản ứng ổn định và hiệu quả, vật tư tiêu hao PCR có độ mỏng đồng đều là lựa chọn tốt nhất.

6. ĐỘ TRONG SUỐT

Nắp ống và màng film dán đĩa qPCR cần có độ trong suốt quang học cao để đảm bảo khả năng xuyên thấu và truyền tín hiệu huỳnh quang tốt nhất, giảm độ méo tín hiệu (đối với các thiết bị qPCR đọc từ trên xuống). Độ trong suốt của thành ống càng cao thì kết quả phản ứng qPCR càng tốt. Lý do đã được giải thích ở trên. PCR truyền thống có thể bỏ qua đặc điểm này.

7. BO VIỀN ĐĨA VI GIẾNG

Bo viền đĩa vi giếng PCR đóng vai trò là giá đỡ ổn định cho quá trình hút mẫu khi chuẩn bị phản ứng và mang đến độ bền cơ học và độ bám khi kết hợp các hệ thống tự động. Có ba loại phổ biến: không bo viền (non-skirted), bo viền một nửa (haft-skirted) và bo viền hoàn toàn (full-skirted) (tương ứng với A, B và C trong hình bên dưới).

• Đĩa không bo viền: Có thể sử dụng với hầu hết các thiết bị PCR hoặc qPCR, nhưng không dành cho các ứng dụng hệ thống tự động. Dễ bị di chuyển trong quá trình hút mẫu, cần sử dụng với giá đỡ đĩa.
• Đĩa bo viền một nửa: Dành cho các ứng dụng tự động với độ cố định hút mẫu tốt.
• Đĩa bo viền hoàn toàn: Rất phù hợp cho các ứng dụng tự động. Độ bền cơ học tốt, phù hợp với các thiết bị PCR có mô-đun nhô ra và tính cố định cao trong quá trình hút mẫu.

Tip: Ý nghĩa của bo viền là tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý mẫu tự động khi kết hợp với cánh tay robot. Tiêu chí này có thể không quan trọng khi lựa chon đĩa PCR cho phòng thí nghiệm nghiên cứu thông thường vì đĩa không bo viền là đáp ứng được.

8. MÀNG FILM DÁN ĐĨA

Phim niêm phong PCR được làm bằng nhựa trong suốt hoặc giấy bạc. Phim trong suốt có keo dính phổ biến hơn, phù hợp với các tấm 96 hoặc 384 giếng, có khả năng truyền sáng đủ tốt. 

Đọc thêm về cách lựa chọn film dán đĩa phù hợp nhé: Tại sao màng film dán đĩa PCR lại cần thiết?

Vì tiếp xúc trực tiếp với mẫu và ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả tín hiệu phản ứng PCR/qPCR, hiểu và lựa chọn vật tư tiêu hao phù hợp rất quan trọng để cải thiện chất lượng dữ liệu nghiên cứu thực nghiệm. Một vài lưu ý nhỏ được chia sẻ ở trên mong rằng có thể hỗ trợ bạn trong quá trình lựa chọn.