VI SINH DƯỢC PHẨM: Lạ mà Quen

Khi nói về thử nghiệm vi sinh Dược phẩm, chúng ta vẫn quen thuộc với các thử nghiệm: Thử hoạt lực kháng sinh, Thử giới hạn nhiễm khuẩn, Thử vô khuẩn… Mục tiêu thử nghiệm tập trung vào kiểm nghiệm vi sinh môi trường các khu vực sạch theo các cấp độ sạch (A, B, C, D); kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào (hoạt chất, tá dược, vỏ nang…); kiểm nghiệm bán thành phẩm, thành phẩm. 

Có thể thấy, trong các tài liệu như EU-GMP, Dược điển, Hướng dẫn của ASEAN, Hướng dẫn thực hành tốt sản xuất thuốc… các quy trình thử nghiệm vi sinh đều được hướng dẫn khá cụ thể. Tuy nhiên, đặc thù của thử nghiệm vi sinh khác với hóa lý là quy trình nuôi cấy, thao tác với tác nhân sống, nhiều yếu tố ảnh hưởng nên trong quá trình thực hiện sẽ phát sinh rất nhiều vấn đề đặc thù. Một vài chia sẻ từ kinh nghiệm cũng như từ tham khảo tài liệu dưới đây, mong rằng sẽ giúp bạn ít nhiều trong quá trình thực hiện các phép thử vi sinh Dược phẩm để tuân thủ các quy định hiện hành GMP, EU-GMP cũng như để kiểm soát chất lượng sản phẩm một cách tốt nhất.

Môi trường thử nghiệm

Tùy theo tính chất hoạt động và loại thử nghiệm mà khu vực phòng thử nghiệm vi sinh cũng được phân chia cấp sạch A, B, C, D và E hoặc không phân cấp dựa trên chỉ tiêu giới hạn tiểu phân. Giới hạn vi sinh được kiểm soát song song với chỉ tiêu giới hạn tiểu phân từ khi thẩm định đến khi kiểm soát môi trường thường xuyên khi vận hành.

Một số vấn đề Lạ mà Quen:

• Ở cấp sạch B không được để thiết bị hay kệ tủ vậy môi trường và dụng cụ sau khi hấp xong nếu không sử dụng ngay sau khi pha chế thì xử lý thế nào? Sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường được bảo quản trong tủ lạnh ở khu vực D và được chuyển vào khu vực thử nghiệm khi tiến hành thử nghiệm. Phòng thí nghiệm nên có các biện pháp để kiểm soát được tạp nhiễm vi sinh vật vào bao bì bọc dụng cụ/môi trường trước khi đưa vào khu vực thử nghiệm (lau cồn 70 độ bên ngoài chai môi trường, bao gói dụng cụ nhiều lần…).
• Có quy định nào về kiểm soát nhiệt độ cho các phòng thử nghiệm không? ISO 14644, Part 4, Annex F: độ ẩm 30-65%; không quy định cụ thể nhiệt độ. Đa số các phòng thí nghiệm vi sinh của các công ty Dược hiện tại đang áp dụng nhiệt độ <26oC, nhiệt độ này cho phép kiểm soát tốt hơn vi sinh vật tạp nhiễm trong phòng thí nghiệm, đảm bảo các tủ ấm hoạt động bình thường (vì các tủ ấm thường kiểm soát nhiệt độ của tủ từ nhiệt độ phòng + 5oC). Các phòng thay đồ, đọc kết quả, chuẩn bị môi trường, air lock cũng cần được kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm. Vì các phòng này đều nằm trong hệ thống phòng sạch. Ngoài ra, một điểm khá quan trọng khi kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm để đảm bảo kiểm nghiệm viên được thoải mái khi làm việc, tối thiểu việc tạo ra tiểu phân, giảm thiểu sai sót khi thao tác.
• Yếu tố con người là một trong những tác nhân chính tạo nguy cơ nhiễm vi sinh cho phòng thí nghiệm, vậy cần lưu ý gì về quá trình thay trang phục khi vào các khu vực sạch? Theo WHO TRS 961, Annex 6 yêu cầu không được mặc quần áo thường phục vào khu C, B trong khi chỉ cần che kín râu tóc, mặc quần áo và mang giày/bao giày phù hợp khi vào khu D. Nếu từ khu D vào khu C: có thể mặc đồ khu C bên ngoài đồ khu D. Nếu từ khu D vào khu B: nên cởi đồ khu D ra, rồi mặc đồ khu C, tiếp đến mặc đồ B (nếu mặc cả 3 bộ B, C, D thì sẽ rất vướng víu cho kiểm nghiệm viên). Đặc biệt, đối với trang phục cho khu vực cấp A, B vải quần áo phải bằng chất liệu chuyên dụng không nhả sơ tiểu phân và có thể giữ tiểu phân không phát tán ra bên ngoài.

• Quy định về cấp sạch cho từng khu vực theo Appendix 1 – Annex 2 – TRS 961 không thấy đề cập đến khu vực đọc kết quả, kiểm soát khu vực này như thế nào? Khu vực đọc kết quả chung với khu vực nuôi cấy sẽ thuận tiện. Nên bố trí tủ BSC tại khu vực này để tránh tạp nhiễm vì mẫu kiểm nghiệm vi sinh thường được đọc trong nhiều ngày, nhiều lần.
• Khu vực lấy dụng cụ và môi trường ra khỏi nồi hấp với phép thử vô khuẩn có cấp sạch B chọn nồi hấp loại nào? Nồi hấp 2 cửa là sự lựa chọn tốt. Tuy nhiên, việc này cũng hơi bất tiện (nếu sử dụng dụng cụ cho phép thử vô khuẩn thì phù hợp, nhưng nếu dùng cho các phép thử khác thì bất tiện vì phải vào khu vực B mới lấy được dụng cụ). Có thể khắc phục việc này bằng cách chỉ sử dụng nồi hấp 1 cửa nhưng bao gói dụng cụ hấp tiệt khuẩn cho phép thử nhiều lần. Bao gói được tháo bỏ dần ở các passbox trước khi đưa vào khu vực thử nghiệm.

• Khu vực phòng rửa - xử lý mẫu sau kiểm nghiệm có cần phân loại cấp sạch khu vực đó không? Theo Tài liệu WHO TRS 961 của WHO: Khu vực rửa dụng cụ không cần đạt cấp độ sạch D, nhưng vẫn cần kiểm soát để tránh tạp nhiễm ra khu vực khác. Khu vực rửa dụng cụ nên được thiết kế có áp suất thấp hơn khu vực liền kề để tránh tạp nhiễm.
• Trong khu vực thử vô khuẩn, có bắt buộc thực hiện cả hai biện pháp: Lấy mẫu không khí và đặt đĩa thạch? Trong WHO TRS 961, Annex 2: Khu vực thử vô khuẩn được khuyến cáo kiểm soát vi sinh theo các cách khác nhau (VD: lấy mẫu chủ động - lấy mẫu không khí và thụ động - đặt đĩa thạch). Phòng thí nghiệm có thể lựa chọn cho phù hợp với điều kiện của mình. Nên thực hiện lấy mẫu đĩa thạch trong BSC class A; lấy mẫu không khí + đĩa thạch trong cấp B. Dược điển USP 43 <1116> khuyến cáo sử dụng môi trường CSA (TSA, SCDM) để kiểm tra vi sinh vật trong không khí.
• Trả kết quả đối với phương pháp phết lấy mẫu như thế nào? Đối với các thiết bị có cấu tạo dạng ống hoặc vị trí lấy mẫu hẹp chúng ta sử dụng phương pháp phết thì sẽ trả kết quả trên đơn vị Qui về số lượng vi sinh vật có trong diện tích tương đương với diện tích đĩa thạch có đường kính 5,5 cm.
• Lựa chọn tủ nuôi cấy như thế nào và cần lưu ý gì với khu vực lắp đặt các loại tủ nuôi cấy? Tủ nuôi cấy được đặt ở cấp sạch nào sẽ được áp mức nhiễm khuẩn của cấp sạch đó (TRS 961, Annex 2, Annex 6). Thử vô khuẩn: Tủ cấy (BSC/LAF) bắt buộc đặt trong khu vực B hoặc Tủ cách ly (isolator) được đặt trong khu vực tối thiểu cấp D. Thử giới hạn nhiễm khuẩn, Định lượng kháng sinh: Tủ cấy (BSC) đặt trong khu vực D. Các khu vực nuôi cấy và thử nghiệm phải thực hiện kiểm tra không khí và bề mặt ít nhất 1 tuần/lần nếu có hoạt động thử nghiệm (gồm lấy mẫu không khí khu vực nuôi cấy bảo quản, các tủ nuôi cấy, BSC...).
• Thiết kế phòng định lượng kháng sinh đẩy gió ra hay vào? Phép thử định lượng kháng sinh có thao tác đổ môi trường chứa vi sinh vật ngoài tủ BSC nên khu vực này nên được thiết kế áp suất âm so với khu vực bên cạnh. Vì vậy cũng nên thiết kế họng cấp HEPA ở ngay cửa ra vào, họng hồi khí ở phía bên trong phòng.
• Hệ thống AHU có cần hoạt động 24/24? Nên bật AHU 24/24 để đảm bảo điều kiện sạch được duy trì liên tục. Tuy nhiên, việc bật liên tục như thế rất tốn kém và giảm tuổi thọ AHU, nên có thể cân nhắc tắt AHU khi đã thẩm định thời gian cần thiết để hệ thống hồi phục đến trạng thái sạch khi bật hệ thống trở lại.

Chuẩn bị dụng cụ

Để hoàn thành một thí nghiệm vi sinh, rất nhiều dụng cụ và tiêu hao được sử dụng từ đĩa petri, đầu tip, ống/bình chứa mẫu, ống nghiệm, ống ly tâm, que trải, bình môi trường, kéo... tất cả đều tiếp xúc trực tiếp với mẫu thử nghiệm. Vì vậy, từ khâu rửa, sấy cho đến hấp tiệt trùng đều cần được thực hiện cẩn thận.

Một số vấn đề Lạ mà Quen:

• Có cần phải hấp dụng cụ pha chế môi trường không? Dụng cụ để pha chế môi trường trước khi hấp không nhất thiết phải hấp tiệt khuẩn. Tuy nhiên, cần làm sạch, sấy khô để giảm thiểu số lượng vi sinh vật bên trong trước khi hấp, để tăng hiệu quả tiệt khuẩn. Trong quy trình hấp của nhiều công ty lựa chọn thông số Fo rất thấp, vì họ kiểm soát được số lượng vi sinh vật bị tạp nhiễm trong sản phẩm trước khi hấp rất nhỏ.
• Có thể dùng túi PE để bao gói hấp khử trùng không? Túi PE chịu nhiệt nhưng lại không thấm nhiệt, không giúp cho quá trình tiệt khuẩn vật đựng trong túi, chính vì vậy, phải sử dụng túi bán thấm: 1 mặt là PE, mặt kia là giấy để cho phép nhiệt đi qua túi để tiệt khuẩn vật đựng trong túi. Đã từng có những quy trình hấp được thẩm định sử dụng túi PE, các thông số nhiệt không đáp ứng, nên phải chuyển sang sử dụng túi bán thấm.

• Có cách nào để tẩy ố trên dụng cụ thủy tinh không? Đối với dụng cụ thủy tinh, nếu ngâm trong dung dịch sulfocromic acid 1:1 sẽ loại được rất tốt các vết ố bám trên dụng cụ. Tuy nhiên, dung dịch này độc hại, nên hạn chế sử dụng. Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch Extran 5%, được pha loãng từ dung dịch đậm đặc dạng thương phẩm trên thị trường.

Chuẩn bị môi trường

Môi trường vi sinh chính là “bể thức ăn” cho vi sinh vật tăng sinh và phát triển. Về cơ bản, có thể chia thành 02 nhóm chính: môi trường tăng sinh (cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, pH phù hợp để vi sinh vật tăng sinh tự do) và môi trường chọn lọc/phân lập (có các yếu tố chọn lọc chỉ cho phép 01 loài hoặc 01 chi vi sinh vật phát triển và tạo kiểu hình khuẩn lạc hoặc cho các phản ứng sinh hóa đặc trưng).

Đối với kiểm nghiệm vi sinh Dược phẩm, việc lựa chọn một loại môi trường vi sinh (phổ biến là dạng bột được phối trộn sẵn - DCM) khó có thể là một quyết định chủ quan vì dù là của nhà sản xuất nào, chúng luôn được kiểm soát bởi 02 bước bắt buộc: Kiểm tra chất lượng môi trường (với chủng chuẩn vi sinh vật) và Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm (với chủng chuẩn vi sinh vật và mẫu thử) được quy định rõ ràng trong các Dược điển.

Một số vấn đề Lạ mà Quen:

• Môi trường ban đầu mua về đã được kiểm tra chất lượng môi trường. Vậy bao lâu thì cần tái kiểm? Kiểm tra cảm quan, lot, date khi mới nhận và cần phải kiểm tra đầy đủ chỉ tiêu theo quy định trên từng lô pha chế. USP 43 <71> quy định: “Growth promotion test: Test each lot of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from ingredients”. DĐVN 5, phụ lục 13.7 cũng chỉ ra: “Tiến hành kiểm tra chất lượng đối với mỗi lô môi trường pha chế sẵn hoặc mỗì lô môi trường được pha chế từ môi trường khô hay từ các thành phần riêng lẻ”.
• Có thể sử dụng chủng chuẩn định tính trong kiểm tra chất lượng môi trường không? DĐVN 5, phụ lục 13.7 yêu cầu về kiểm tra chất lượng môi trường như sau: “Cấy không quá 100 CFU vào từng lọ môi trường, chính vì vậy, cần phải xác định được số lượng chủng vi sinh vật trước khi cấy”. 
       - Nếu sử dụng chủng có số lượng xác định (mua sẵn, công bố số lượng trên CoA): có thể sử dụng trực tiếp, cấy vào môi trường. 
        - Nếu sử dụng chủng không có số lượng xác định: cần phải cấy truyền chủng và đếm số lượng, sau đó mới tạo hỗn dịch chủng có nồng độ mong muốn và cấy vào môi trường.
• Môi trường sau hấp khử trùng cho phép thử Giới hạn nhiễm khuẩn có yêu cầu bảo quản ở 2-8°C không? Không có tài liệu nào bắt buộc phải bảo quản môi trường sau khi hấp khử trùng trong tủ lạnh. Có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (PTN) và nhưng phải chấp nhận thời gian bảo quản sẽ ngắn hơn. Do vậy, PTN cần thẩm định điều kiện bảo quản môi trường sau hấp phù hợp với điều kiện hiện có của PTN, lưu ý quan trọng là tránh tạp nhiễm
• Nếu hấp môi trường tại khu vực cấp sạch D, bảo quản tại khu vực cấp sạch E cần lưu ý điều gì? Cần có các biện pháp tránh nhiễm chéo vào môi trường, đặc biệt là môi trường cho phép thử vô khuẩn (bao gói nhiều lần, lau cồn 70o bên ngoài chai môi trường trước khi đưa vào khu vực có cấp sạch cao hơn...)
• Có thể làm chảy môi trường thạch bằng lò vi sóng không? Nên làm chảy môi trường bằng cách đun sôi cách thủy. Không được hấp tiệt trùng lại vì có thể ảnh hưởng đến chất lượng môi trường. Tuyệt đối không dùng lò vi sóng (quy định trong TRS 961, Annex 2)
• Thời gian bảo quản các môi trường thạch đã được đổ ra đĩa nuôi cấy là bao lâu? Môi trường đổ đĩa thạch thường được bảo quản 2 – 8oC/2 - 4 tuần (tham khảo từ các đơn vị đã thẩm định và thực hiện). Nếu muốn bảo quản trong thời gian dài hơn, ví dụ như môi trường phân lập vi sinh vật gây bệnh 2 – 8oC/1 tháng, môi trường TSA, SA: 2 – 8oC/2 tháng, thì cần thầm định để có hồ sơ chứng minh điều kiện bảo quản như trên.
• Có thể tiến hành song song pha chế môi trường và vừa kiểm tra chất lượng để đảm bảo tiến độ của phép thử không? Chỉ cần chắc chắn rằng kết quả kiểm tra môi trường sẽ có trước khi trả kết quả kiểm nghiệm để đảm bảo độ tin cậy cho kết quả kiểm nghiệm là được

Hãy cùng đóng góp thêm kinh nghiệm “Lạ mà Quen” của bạn cùng với BIOMEC nhé!